Аннотация результатов, полученных в 2014 году
На первом этапе исследования нами был проведен 3D молекулярный докинг потенциальных лигандов асиалогликопротеинового рецептора (ASGPR) и простатного специфического мембранного антигена (PSMA). Как и другие представители этого класса, ASGPR связывается с углеводами и в значительном количестве (~5∙105 молекул на клетку) экспрессируется в паренхимных клетках печени. Сравнительно недавно было показано, что ASGPR способствует метастазированию опухолевых клеток за счет активации рецепторов эпидермального фактора роста – киназный сигнальный путь. В связи с этим ASGPR является перспективной биологической мишенью для разработки новых малых лекарственных молекул, средств диагностики опухолевых заболеваний и нацеленной доставки. Рецептор в качестве эндогенных лигандов распознает концевые галактозные и N-ацетил-галактозаминные остатки. Проведен 3D молекулярный докинг потенциальных лигандов асиалогликопротеинового рецептора (ASGPR). С использованием специальных алгоритмов было проведено реконструирование сайта связывания мутантных форм ASGPR с N-ацетил-D-галактозамином. Был осуществлен молекулярный докинг N-ацетил-D-галактозамина в нативный сайт связывания и определены основные супрамолекулярные взаимодействия. С учетом установленных супрамолекулярных взаимодействий и особенностей сайта связывания были предложены новые молекулы, относящиеся к различным структурным классам органических соединений. Данные соединения будут синтезированы на следующих стадиях проекта. В соответствии с планом синтетических работ проекта на первом этапе нами были разработаны новые и оптимизированы известные методы получения органических низкомолекулярных лигандов-векторов - производные N-ацетилгалактозамина. Полученные утроенные производные N-ацетилгалактозамина содержат в своем составе линкеры различной природы. Для дальнейшей коньюгации лигандов-векторов с терапевтическими агентами в структуру линкера введена азидо-группа, которая будет введена в click-реакцию на следующих этапах исследования. Предложен и синтезирован новый класс производных N-ацетилгалактозамина, содержащих аллильный фрагмент в гликозидном положении. По данным молекулярного моделирования данные соединения должны обладать большей аффинностью к асиалогликопротеиновому рецептору. На следующих этапах планируется изучить сродство новых лигандов к ASGP рецептору. Также проведен дизайн новых малых молекул – потенциальных лигандов PSMA с использованием технологии 3D молекулярного докинга. Был идентифицирован консервативный сайт связывания NAAG и его аналогов, включая известные производные мочевины. В результате компьютерного эксперимента было установлено, что в сайте связывания просматриваются две отдельные области: а) консервативный с минимальной конформационной подвижностью каталитический центр и ближайшее аминокислотное окружение; б) конформационно подвижные аминокислоты, включая R463, R534 и R536, формирующие выход и сайта связывания. С учетом установленных супрамолекулярных взаимодействий и особенностей сайта связывания были предложены новые изостерные модификации глутамил-замещенных мочевин, в которых центральный фрагмент заменен на имидазол и триазол. Данные соединения будут синтезированы на следующих этапах исследования. Получены лиганды PSMA, в том числе и ранее не описанные. Найдены новые и оптимизированы известные протоколы получения уреидов на основе аминокислот (L-лизин, L-глутаминовая кислота). Предложены структуры четырех новых линкеров - фрагментов отвечающих за конъюгацию вектора и терапевтического фрагмента. Все цели и задачи проекта выполнены в полном объеме.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Поиск высокоэффективных и нетоксичных лекарственных препаратов магистральная задача современной медицинской химии. Среди наиболее распространенных заболеваний, онкологические заболевания простаты и метаболические заболевания печени являются основной причиной смертности. При выполнении работ проекта, на втором этапе настоящего проекта разработана платформенная технология, основанная на получении коньюгатов терапевтических агентов с низкомолекулярными векторами, обеспечивающими доставку лекарства к пораженному органу или ткани. Преимуществами такой технологии является: уменьшение общей токсичности препарата (за счет адресности действия), терапевтическая доза может быть снижена, а так же не требуется оптимизация терапевтической молекулы. Анализ доступных литературных источников свидетельствует о том, что в последнее время наибольшее внимание исследователей, с точки зрения разработки новых средств нацеленной доставки лекарственных молекул (ЛМ) и диагностики, привлекают PSMA-векторы (лиганды) на основе производных мочевин, среди которых особенно выделяют DCL (уреид на основе лизина и глутамина) и DUPA (уреид на основе глутамина), демонстрирующие высокую аффинность по отношению к PSMA-R. В связи с доступностью исходных материалов, а также ввиду относительного удобства синтетических процедур, нацеленных на модификацию структуры лиганда, в особенности линкерной области, в качестве основного скэффолда на данном этапе был выбран DCL. Ранее нами был разработан оптимизированный протокол синтеза уреида на основе L-лизина и L-глутамина, на данном этапе нами были получены конъюгаты доксорубицина и паклитакселя с лигандом DCL. Особое внимание было уделено получению линкеров различной природы, связывающих терапевтический фрагмент и вектор. На основании результатов молекулярного докинга, было установлено, что наибольший вклад в уменьшение константы ингибирования вносят гидрофобные взаимодействия между компонентами линкера и сравнительно длинным туннелем в структуре PSMA-R, в конце которого находятся два гидрофобных кармана, располагающиеся на выходе из этого пакета. В соответствии с этим было выдвинуто предположение о том, что введение гидрофобных фрагментов, например ароматических аминокислот, в наиболее подходящее положение в линкере, позволит улучшить аффинность конъюгатов. В частности, подходящим для осуществления таких дополнительных взаимодействий является структурный фрагмент на основе дипептида фенилаланина. Был дополнительно разработан синтетический протокол получения таких конъюгатов и исследованы их свойства. Также нами была проведена оптимизация условий получения лигандов ASGP рецепторов, содержащих один углеводородный фрагмент. Универсальность методики была продемонстрирована на примере трех N-ацетилгексозаминов (N-ацетилгалактозамина (GalNAc),N-ацетилглюкозамина (GlcNAc) и N-ацетилманнозамина (ManNAc)). Описанный подход был применен для получения лигандов ASGP-R рецепторов, содержащих биодеградируемый в физиологических условиях линкер, содержащий гидразидный фрагмент. Всего было синтезировано 15 конъюгатов лекарственных препаратов (доксорубицин, паклитаксель, аторвастатин, фенофибрат) с ASGP и PSMA рецепторами, содержащие линкеры различной природы. При выполнении работ второго этапа, в 2015 году нами были синтезированы модифицированные короткие интерферирующие РНК, обеспечивающие подавление экспрессии белка TTR, шаперона ASHA и люциферазы. Для увеличения стабильности РНК in vitro и in vivo ряд рибонуклеотидов были заменены на 2’-дезокси-2’-фтор- и 2’-О-метильные аналоги, а также часть фосфодиэфирных групп были заменены на тиофосфодиэфирные. При этом смысловая цепь РНК дуплекса содержала терминальный алкин на 5’-конце, что позволило постсинтетически провести ее конъюгация с азидными производными лигандов с использованием реакции 1,3-диполярного циклоприсоединения. Предложенная схема позволяет быстро проверять эффективность и специфичность доставки in vitro и in vivo, так как шаперон ASHA экспрессируется в большинстве типах клеток, а возможность пост-синтетической функционализации РНК сокращает время синтеза, по сравнению с традиционными подходами. В качестве лигандов, которые обеспечивают доставку в клетки за счет рецептор-опосредованного эндоцитоза, были взяты производные N-ацетилгалактозамина (лиганды асиалоглипротеинового рецептора, доставка в гепатоциты печени) и уреидные производные (лиганды мембранного антигена, специфичного для рака простаты). На заключительно этапе проекта проводили первоначальный скрининг in vitro с целью поиска соединений-лидеров для дальнейших работ in vivo. В эксперименте использовали клеточные линии рака предстательной железы LNCaP и PC-3. По результатам анализа, было показано, что флуоресцентный конъюгат PSMA лигандов являются высокоселективными. Так же нами было исследовано накопление доксорубицина и конъюгатов доксорубицина с PSMA векторами в клеточных линиях LNCaP и PC-3. Была разработана экспресс-система для оценки взаимодействия синтезированных коньюгатов терапевтических олигонуклеотидов с PSMA рецептором. При инкубировании клеток PC3, LNCaP, Hek293T и MCF7 в течении 30 минут при комнатной температуре с 2 мкМ раствором коньюгата FAM-5'-CTCCCTCTCACTCCCCAATACGGAG AGAAGAACGATCATCAATGGCTGAC-3'-линкер-(Glu-urea-Lys) доля клеток, флуоресценция которых достоверно превышает сигнал автофлуоресценции составила 10-30% для линии LNCaP с высоким уровнем экспрессии и практически не детектировалось в других линиях. Чтобы показать возможность специфического взаимодействия с мишенями в клетке, последовательность олигонуклеотида в конъюгате была выбрана комплементарная U3 РНК. В ряде клеток LNCaP удалось детектировать структуры, судя по окрашиваниюDAPI, локализующиеся в ядрышке, в котором и находится целевая РНК U3. Нами была исследована цитотоксичность новых конъюгатов доксорубицина в различных клеточных линиях, включая LNCaP (экспрессирующие PSMA) и РС-3(не экспрессирующие PSMA). В результате проведенных исследований было установлено, что среди полученных конъюгатов соединение, содержащее фрагмент дипептида фенилаланил-фенилаланина проявляет наибольшую активность на клеточной линии LNCaP (PSMA «+»). Данное соединение перспективно для дальнейших in vivo исследований.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В 2014-2016 году найден ряд эффективных конъюгатов противоопухолевых препаратов нацеленных на терапию аденокарциномы предстательной железы, а так же препараты для лечения метаболических заболеваний печени. Оптимизирован синтез новых лигандов асиалогликопротеинового рецептора (ASGPR). Наилучшие показатели аффинности по отношению к рецептору показал лиганд разветвленного строения с тремя остатками аллилгликозида-N-ацетилгалактозамина (KD = 0.76 нМ). Также предложен новый лиганд ASGPR неуглеводной природы, содержащий хинолиновый фрагмент (KD = 327 нМ). Аффинность обоих соединений превосходит показатель для эндогенного лиганда N-ацетилгалактозамина (KD = 448 мкМ). Оптимизирована процедура получения ковалентных конъюгатов доксорубицина, метотрексата и паклитакселя с производными N-ацетилгалактозамина и N-ацетилглюкозамина с использованием различных синтетических подходов. Для паклитаксела была проведена оптимизация условий этерификации 5-гексиновой кислотой с получением производных, замещенных в положение 7-ОН и в фенилизосериновый фрагмент исходной структуры. На примере метотрексата предложен метод, в котором молекула противоопухолевого препарата выступает в качестве платформы для построения разветвленных гликоконъюгированных систем. Осуществлено взаимодействие аторвастатина с лигандами ASGPR на основе производных N-ацетилгалактозамина, содержащими концевую аминогруппу. Образование конъюгата аторвастатина было зафиксировано методом ВЭЖХ/МС. Все полученные конъюгаты терапевтических молекул оказались стабильными в физиологических условиях. Для последующих экспериментов in vivo на крысах Wistar с трансплантированным подкожно альвеолярным слизистым раком печени РС-1, были получены конъюгаты N-ацетилгалактозамина и N-ацетилглюкозамина с флуоресцентным красителем Sulfo-Cy5. Показано, что конъюгаты на основе N-ацетилгалактозамина проникают в клетки рака печени на порядок лучше в сравнении с производными N-ацетилглюкозамина. Синтезированные конъюгаты не проявили токсичности in vivo. Предложена модель ранней диагностики рака печени in vivo с использованием лигандов ASGPR. Было показано, что добавление биотина и/или хлорида кальция в клеточную среду при культивации линии гепатоцеллюлярной карциномы Huh7 со сниженной экспрессией ASGPR способствует увеличению количества рецепторов на поверхности, что ведет к повышенному проникновению лигандов внутрь гепатоцитов. На примере конъюгата лиганда ASGPR(7) с модельной анти-AHA1 миРНК было показано, что добавление хлорида кальция и/или биотина способствует проникновению конъюгата в клетки Huh7 и наблюдается падение уровня экспрессии гена-мишени в 3-5 раз при одинаковой концентрации миРНК. Получена серия адресных конъюгатов доксорубицина и лигандов ПСМА, выявлено соединение-лидер (19) с pH расщепляемым линкером. Методом ВЭЖХ/МС был оценен период полураспада конъюгата при pH 5.0 и 7.4, значения составили 1.25 ч (pH 5.0) и 50 ч (pH 7.4), что подтверждает возможность расщепления целевых конъюгатов в эндосомах с высвобождением лекарственного препарата доксорубицин в свободном виде при рецептор-опосредованным эндоцитозом. Синтезирована серия конъюгатов паклитаксела, модифицированного остатками 5-гексиновой кислоты (в положение 7-ОН и в фенилизосериновый фрагмент) с различными лигандами ПСМА. Исследована цитотоксичность полученных конъюгатов на клеточных линиях рака предстательной железы LNCaP и PC3, изучена зависимость «структура-активность» цитотоксического действия конъюгатов. Цитотоксическая активность конъюгата с амидной связью между линекром и ПСМА-лигандом (IC50 = 25 нМ) на порядок выше, чем у конъюгата с сочленением через фрагмент мочевины (IC50 = 1670 нМ). Продемонстрировано предпочтительное сочленение фрагментов-линкеров и ПСМА-лигандов в структуре конъюгата через амидную связь по сравнению с сочленением через фрагмент мочевины. Все лиганды и конъюгаты в данной работе были выделены в индивидуальном виде и охарактеризованы методами спектроскопии 1H и 13С ЯМР , масс-спектрометрии высокого разрешения и ВЭЖХ/МС. Была изучена экспрессия ПСМА в клеточных линиях рака предстательной железы LNCaP, PC3, MCF-7 и HEK-293 методом проточной флуориметрии с использованием ранее синтезированного флуоресцентного конъюгата (Lys-urea-Glu-Cy5), способного визуализировать ПСМА. Была обнаружена флуоресценция большей части клеток линии LNCaP (89%), большей части клеток MCF-7 (65%) и незначительный сигнал флуоресценции для линий PC3 (1%) и HEK-293 (13%). Показано, что конъюгат Glu-urea-Lys-Cy5 накапливается в цитоплазме клеток LNCaP, чего не происходит на клеточной линии PC3. Впервые показано, что клеточная линия MCF-7, также содержит биомолекулы, способные селективно взаимодействовать с лигандами ПСМА. Методом лентивирусной трансфекция клеточной линии PC3 была получена клеточная линия PC3-PIP (ПСМА+). С использованием клеточной линии PC3-PIP получена ксенографтная мышиная модель рака предстательной железы, на которой проводилось исследование активности конъюгата-лидера in vivo. Было выявлено наличие противоопухолевого эффекта адресного конъюгата доксорубицина по сравнению с контрольной группой. Однако выявленный эффект оказался меньше в сравнении со свободным препаратом доксорубицин, что объясняется недостаточной экспрессией ПСМА в культуре клеток PC3-PIP. Для ряда полученных конъюгатов паклитаксела была исследована цитотоксичность на клеточных линиях LNCaP (ПСМА+) и PC3 (ПСМА-). Конъюгаты с амидным сочленением показали цитотоксичность (IC50 = 25 нМ и 86 нМ), близкую к соответствующим значениям препарата паклитаксел, однако проявили низкую избирательность к ПСМА-экспрессирующей клеточной линии. Конъюгат с мочевинным сочленением показал высокую избирательность по отношению к ПСМА-положительной клеточной линии, что перспективно для дальнейших in vivo исследований. Таким образом, установлено соотношение «структура конъюгата – активность» для конъюгатов паклитаксела с лигандами ПСМА. Синтезированы смысловые цепи ASHA-T XXX-g-g-Af-u-Gf-a-Af-g-Uf-g-Cf-a-Gf-a-Uf-u-Af-g-Uf-invdT и Luc-T XXX-c-u-Uf-a-Cf-g-Cf-u-Gf-a-Gf-u-Af-c-Uf-u-Cf-g-Af-invdT, содержащая на 5’-конце три фрагмента гидроксипролинола, модифицированного 5-гексиновой кислотой. Последующее присоединение азидо производного, содержащее три остатка N-ацетилгалактозамина, позволило ввести в состав конъюгата сразу девять остатков N-ацетилгалактозамина. Были синтезированы конъюгаты коротких интерферирующих РНК, ингибирующих экспрессию терапевтически значимого белка ApoB. Было показано, что уже при 30 нМ концентрации РНК наблюдается эффективное ингибирование экспрессии АроВ в свежевыделенных гепатоцитах мышей. Было отмечено, что добавлении избытка лиганда или хелатирующего агента (EGTA) резко снижает эфекктивность ингибирования. Были синтезированы короткие интерферирующие РНК, направленные на мРНК транстиретина. Среди синтезированных структур, были выбрана структуры-лидеры. Получены конъюгаты миРНК и 2’-OMeРНК (ядрышковая последовательность комплементарная к U3 РНК) с лигандами ПСМА на основе уреида лизина и глутаминовой кислоты. Состав конъюгатов подтвержден методом масс-спектрометрии, индивидуальность с помощью ВЭЖХ. Впервые методом флуоресцентной микроскопии показано, что конъюгат лигандов ПСМА с 2’-OMeРНК к U3 РНК может быть использован для визуализации ядрышек клеток рака предстательной железы. Данный подход универсален и представляет интерес для создания адресных конъюгатов для визуализации in vitro. Впервые продемонстрирован метод адресной доставки миРНК к мРНК AHA1 в культуре LNCaP. Был продемонстрирован 95% нокдаун мРНК AHA1 после инкубации культуры LNCaP с конъюгатом лиганда ПСМА рецептора с миРНК в концентрации 8 мкМ. Данный подход открывает возможность адресной доставки терапевтической миРНК в клетки рака предстательной железы. В рамках выполнения проекта РНФ в Ломоносовском корпусе МГУ имени М.В. Ломоносова открыта новая лаборатория "Тканеспецифических лигандов". В лаборатории могут быть реализованы полноценные исследования от дизайна структуры молекулы до отбора кандидатов предклинических испытаний для лечения социально-значимых болезней.